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外泌體是納米級的細(xì)胞外囊泡，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊。它們在納米醫(yī)學(xué)中具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，其分離技術(shù)因為昂貴儀器和試劑受到限制。仿生納米技術(shù)為藥物、RNA干擾（RNAi）、蛋白質(zhì)遞送和無藥物療法提供強(qiáng)大的支架，極大地影響了生物醫(yī)學(xué)。在大流行期間，納米技術(shù)在世界范圍內(nèi)mRNA疫苗和診斷試劑盒的開發(fā)中發(fā)揮了重要作用。然而，傳統(tǒng)納米材料在臨床的轉(zhuǎn)化因靶點(diǎn)識別能力差和成本高昂從而受到影響。在這方面，外泌體可能是解決上述問題的一個不錯選擇。
外泌體是細(xì)胞外囊泡，大小范圍為30-200 nm，幾乎所有類型的細(xì)胞都會分泌。它們通過攜帶DNA、RNA、RNAi、蛋白質(zhì)、病毒、脂質(zhì)、小分子和可溶性因子等多種有效載荷參與細(xì)胞間通訊。這些物質(zhì)以旁分泌方式從親本（供體）輸送到受體細(xì)胞。外泌體繼承了有效載荷傳遞能力，這使它們成為藥物輸送的理想載體，通過將所需的物質(zhì)裝載在其內(nèi)部或表面。外泌體也可用作某些疾病的診斷標(biāo)志物，例如神經(jīng)退行性疾病和癌癥。外泌體還有穿越體內(nèi)所有生理屏障的能力，以及與血腦屏障（BBB）相關(guān)的能力，這在改善腦部疾病或切除腦癌方面存在重大意義。外泌體可以從所有體液中分離出來，包括血漿、尿液、腦脊液、羊水、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡杠桿、細(xì)胞培養(yǎng)等，它們大量存在于所有體液中。基于外泌體的無細(xì)胞療法具有高濃度和易于進(jìn)入細(xì)胞和器官的特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)中具有顯著的優(yōu)勢。
有幾種有效的外泌體分離方法，包括原型超速離心（用于80%的細(xì)胞外研究）、通過聚乙二醇（PEG）的密度梯度試劑、尺寸排阻色譜（SEC）和免疫沉淀等。然而，這些方法有一定的局限性，即超速離心機(jī)或商業(yè)試劑盒的成本高。此外，分離的外泌體樣品的純度、大小和濃度及其功能取決于所采用的分離方法。
凍干（真空冷凍干燥）現(xiàn)在通常用于延長富集外泌體的儲存時間。目前，它在外泌體分離中的應(yīng)用是比較新穎的。有趣的是，大多數(shù)外泌體儲存緩沖液都有一個維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。例如，4%海藻糖或10% w/v山梨糖醇和蔗糖有利于富集外泌體顆粒的冷凍干燥。同樣，理想的pH值為6.5-7.5，氨基酸、谷氨酸和1%FBS對外泌體的凍干過程是有利的，以避免冷凍休克并保持外泌體顆粒的結(jié)構(gòu)完整性。同樣，對于細(xì)胞培養(yǎng)基，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）富含葡萄糖，pH值為6.8-7.4，主要富含L型谷氨酸，并補(bǔ)充10%FBS。與凍干的外泌體顆粒儲存培養(yǎng)基類似，也就是說細(xì)胞培養(yǎng)基可以保護(hù)外泌體。因此，基于凍干的技術(shù)能夠通過冷凍干燥老化的細(xì)胞培養(yǎng)基來分離外泌體。然而，我們?nèi)匀恍枰揽總鹘y(tǒng)的外泌體分離技術(shù)進(jìn)行洗滌。盡管SEC或超速離心可以在一定程度上達(dá)到這種效果，但沒有一種分離方法可以純化外泌體樣品免受蛋白質(zhì)污染。
外泌體分離技術(shù)的比較研究評估了用于外泌體純化的各種商業(yè)試劑盒的效率、純度和可重復(fù)性及其在血漿和血清樣品中的 miRNA 質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)血清適合外泌體的分離，并且具有更多種類的外泌體 miRNA。研究還發(fā)現(xiàn)，每種分離方法在純度、外泌體數(shù)量和種類含量方面都存在一定的局限性。相比之下，血漿更有利于外泌體分離。對于所有類型的外泌體樣本，與商業(yè)試劑盒相比，即使是超速離心也受到產(chǎn)量較低的限制，但純度相對較高。研究表明，外泌體貨物的檢測和分離取決于所采用的分離程序。基于凍干外泌體的分離方法因其簡單性和成本效益而是一種不錯的選擇。
外泌體掃描電子顯微照片，比例尺：200 nm
使用凍干方法分離外泌體，并使用掃描電子顯微鏡 （SEM） 表征大小和形狀。此外，納米顆粒追蹤分析（NTA）用于準(zhǔn)確揭示樣品中外泌體的濃度和大小。貼壁細(xì)胞系和懸浮細(xì)胞系的細(xì)胞外囊泡平均大小均約為140 nm，這與報道的外泌體大?。?0-200 nm）相符?；诘鞍踪|(zhì)的外泌體的平均濃度可滿足下游應(yīng)用。一般外泌體表面的蛋白標(biāo)記物被認(rèn)為是其表征的標(biāo)準(zhǔn)。例如，CD9、CD63 和 CD81 是內(nèi)體特異性四跨膜蛋白。CD9首先在從樹突狀細(xì)胞中分離的外泌體上被發(fā)現(xiàn)。TSG101和HSP70是轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物所需的內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT）復(fù)合物的組成部分，在外泌體生成中起著重要作用。鈣聯(lián)蛋白（Calnexin）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物，主要被評估為外泌體的陰性對照，主要存在于相對較大的囊泡上，而CD63存在于較小的囊泡上。Western blot試驗證實，除鈣聯(lián)蛋白外，所有這些重要標(biāo)記物都存在于分離的外泌體表面。
外泌體在納米醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用有利于藥物遞送和診斷。研究人員通過用達(dá)沙替尼和普納替尼負(fù)載這些分離的外泌體來評估這些外泌體的藥物負(fù)載和釋放能力（達(dá)沙替尼和普納替尼被用作Ph+白血病的酪氨酸激酶抑制劑），觀察到外泌體可以有效地負(fù)載藥物并將藥物遞送至靶細(xì)胞。藥物釋放研究是通過在不同時間點(diǎn)收集樣本在體外進(jìn)行的。在8 h時，藥物釋放最佳，而在12 h時觀察到下降。研究結(jié)果證實了這一點(diǎn)，因為K562是一種白血病細(xì)胞系，具有較低的pH值，這會觸發(fā)藥物從外泌體釋放。
實驗樣本：外泌體
實驗?zāi)康模喝コ兴郑３謽悠访烙^，方便保存及下一步試驗
實驗設(shè)備：
真空冷凍干燥機(jī)Mercury180M
實驗過程：
1、打開凍干機(jī)預(yù)冷，設(shè)置好凍干程序包括預(yù)凍和升華程序。
2、對樣品進(jìn)行前處理，加入合適的保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)凍。如葡聚糖，甘露糖，海藻糖，復(fù)合保護(hù)劑。將樣品分裝到合適的容器內(nèi)，放置于凍干機(jī)隔板上，Mercury凍干機(jī)隔板均勻度達(dá)到了±1°C，可保證樣品的均一凍干狀態(tài)。
3、啟動設(shè)置好的凍干程序，即預(yù)凍至-45℃，持續(xù)時間5h。升華程序-45℃～20℃，持續(xù)時間32h。此步驟可以利用凍干終點(diǎn)判斷功能，預(yù)估完成時間，可縮短反復(fù)查看的時間。
4、程序結(jié)束后，釋壓取出凍干好的樣品，觀察樣品狀態(tài)是否達(dá)到預(yù)期。如果達(dá)到隨即儲存或者進(jìn)行后續(xù)實驗。
實驗結(jié)果：無保護(hù)劑組，外泌體直接凍干，凍干后比較松散。加入5%甘露醇后樣品更為美觀，且保存效果好。
凍干前后對比圖如下：
凍干前 VS 凍干后
左3為加入甘醇后樣品
